李博安教授團隊開(kāi)發(fā)基于RAA-CRISPR/Cas12b的一步法核酸快檢技術(shù)

百日咳是一種由百日咳桿菌引起的急性呼吸道感染，早期診斷對于百日咳的治療至關(guān)重要。目前，實(shí)驗室診斷百日咳常用的方法有:培養法、直接熒光抗體檢測、聚合酶鏈反應(PCR)、配對及單一血清學(xué)技術(shù)。通過(guò)培養分離百日咳桿菌是診斷百日咳的傳統“金標準”，具有大約100%的特異性。然而，基于培養的方法的靈敏度很差，在12% ~ 60%之間，而且這些方法非常耗時(shí)，平均需要5天。

傳統的PCR或逆轉錄PCR (RT-PCR)方法是核酸檢測的金標準，自20世紀90年代以來(lái)，PCR已被用作臨床和非臨床研究環(huán)境中百日咳的診斷工具。然而，PCR技術(shù)需要專(zhuān)業(yè)的人員和設備基礎設施，并且從采樣到結果的時(shí)間也很長(cháng)，不適合簡(jiǎn)單快速的即時(shí)檢測(POC)。核酸等溫檢測技術(shù)，如重組酶聚合酶擴增(RPA)、重組酶輔助擴增(RAA)和環(huán)介導等溫擴增(LAMP)等，具有操作簡(jiǎn)單、恒溫、快速等優(yōu)點(diǎn)，在POC中具有很大的潛力。令人沮喪的是，它們的應用受到限制，因為與qPCR相比，它們的靈敏度較低，而且可能出現假陽(yáng)性結果。

近年來(lái)，基于CRISPR/Cas的核酸檢測方法已廣泛運用于分子診斷。將CRISPR/Cas核酸酶蛋白與等溫擴增技術(shù)相結合，開(kāi)發(fā)了一系列不需要特殊精密儀器的簡(jiǎn)單、快速、靈敏、可視化的核酸檢測方法。例如，基于Cas13a或Cas13b的SHERLOCK核酸檢測平臺，基于Cas12a的DETECTR檢測技術(shù)，以及基于Cas12b的CDetection的檢測方法可以實(shí)現核酸的快速檢測。然而，這些方法需要兩個(gè)步驟，首先擴增目標序列，然后進(jìn)行CRISPR檢測。這樣的多個(gè)處理步驟增加了操作時(shí)間和交叉污染的風(fēng)險。

STOPCovid (SHERLOCK Testing in One Pot)和STOPCovid v2在開(kāi)發(fā)耐熱型嗜酸芽孢桿菌Cas12b (AapCas12b)的基礎上，設計了RT-LAMP來(lái)解決兩步法的問(wèn)題。但是，這些基于LAMP的一鍋檢測需要較長(cháng)的反應時(shí)間，反應溫度為60℃，這限制了LAMP的引物設計，而且溫度高容易造成燒傷，不適合在家庭等場(chǎng)所進(jìn)行檢測。李博安團隊在之前的研究中發(fā)現，CRISPR-Cas蛋白的低順式裂解活性和高反式裂解活性是結合核酸擴增一步檢測的關(guān)鍵，開(kāi)發(fā)了一種不受PAM限制的一步法核酸檢測技術(shù)。近期，研究團隊發(fā)現在較低溫度下，AacCas12b仍保持較高的反式裂解活性，而順式裂解活性極弱，在此基礎上建立了RAA-CRISPR/Cas12b單鍋檢測(Rcod)系統。該研究成果以題為“Rapid and sensitive detection of nucleic acids using an RAA-CRISPR/Cas12b one-pot detection assay (Rcod)”的研究論文在線(xiàn)發(fā)表于Talanta。

該研究發(fā)現AacCas12b在30?C~39?C溫度范圍內仍然具有較高的反式裂解活性，和較低的順式裂解活性，使得AacCas12b和較低溫度的等溫擴增（如RAA）建立一鍋法成為可能。在Rcod體系中，AacCas12b的裂解和等溫擴增同時(shí)發(fā)生在一個(gè)試管中，具有高反式裂解活性和低順式裂解活性的AacCas12b對體系中核酸的干擾弱于具有高順式裂解活性的AacCas12b，展現出較高的靈敏度和可靠性。

與傳統的基于CRISPR的檢測方法相比，直接在一管中進(jìn)行RAA擴增和AacCas12b切割的系統更方便實(shí)現，避免了兩步法的繁瑣操作。與其他Cas12b一步檢測方法相比，Rcod系統具有靈敏度高(0.2 copies/μL)、耗時(shí)短(30 min以?xún)?/span>)的優(yōu)點(diǎn)。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，Rcod聯(lián)合無(wú)核酸提取法在30 min內對221份臨床標本進(jìn)行百日咳檢測，靈敏度為97.96%，特異性為99.19%，準確率為98.64%。總之，Rcod系統是一種一步、簡(jiǎn)單、快速的核酸檢測方法，具有較高的靈敏度和特異性，為POC的診斷提供了一種快速的診斷方法。

該論文的第一作者為廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生林康鳳，國家兒童醫學(xué)中心姚開(kāi)虎教授以及廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士生李簫和李清涵為本文的共同第一作者，廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授、廈門(mén)大學(xué)醫學(xué)院李志勇教授和廈門(mén)大學(xué)醫學(xué)院楊曉慶教授為該文章的共同通訊作者。