李博安教授團隊開(kāi)發(fā)基于CRISPR/Cas12a不受PAM限制的一步法核酸快檢技術(shù)

近幾十年來(lái)，由病原體百日咳桿菌（BP）、流感病毒、SARS-CoV-2等引起的呼吸道傳染病嚴重威脅著(zhù)人類(lèi)健康，尤其是2019年爆發(fā)的2019年冠狀病毒?。ㄐ鹿诜窝祝?。核酸的快速、早期和準確檢測對于疾病的診斷、治療方案的評估、預防措施的制定、耐藥性的評估等具有重要意義，這反過(guò)來(lái)可以防止疾病傳播的風(fēng)險。

CRISPR自問(wèn)世以來(lái)因其快速、敏感、特異性強、反應恒溫等特點(diǎn)，被廣泛的用于分子診斷，如張鋒團隊建立的SHERLOCK核酸檢測平臺、Jennifer 團隊建立的DETECTR檢測技術(shù)等。然而，這些基于CRISPR/Cas的檢測策略，crRNA的設計受到原間隔物相鄰基序位點(diǎn)（PAM）序列限制，且通常需要分步驟進(jìn)行，要求首先對核酸進(jìn)行預擴增，然后將擴增產(chǎn)物轉移到CRISPR/Cas系統進(jìn)行核酸檢測，這種多步驟反應方法不僅麻煩且耗時(shí)，而且容易受到氣溶膠污染的影響。為了避免開(kāi)蓋污染這個(gè)問(wèn)題，李博安團隊前期將CRISPR技術(shù)與微流控芯片結合，實(shí)現反應自動(dòng)化，避免了額外的移液步驟（(Sun et al., Science China-Chemistry，2022）。近期，研究團隊在進(jìn)一步的研究中開(kāi)發(fā)了一種不受PAM限制的一步法核酸檢測技術(shù)，恒溫擴增與基因編輯檢測在同一個(gè)反應管里進(jìn)行，無(wú)需產(chǎn)物轉移步驟，簡(jiǎn)單方便且敏感度高，該研究成果以題為“Fast and visual detection of nucleic acids using a one-step RPA-CRISPR detection (ORCD) system unrestricted by the PAM”的研究論文在線(xiàn)發(fā)表于ANALYTICA CHIMICA ACTA。

該研究通過(guò)對CRISPR/Cas12a識別PAM和非PAM靶標的切割活性進(jìn)行研究，發(fā)現與識別PAM靶標對比，Cas12a識別非PAM靶標的cis切割靶標模版的能力明顯變弱，但trans切割單鏈DNA探針的能力保持不變。研究團隊隨即將CRISPR/Cas12a與RPA恒溫擴增技術(shù)結合，一步法檢測64種隨機的PAM（TTTN）靶標，發(fā)現在一步CRISPR檢測中，最優(yōu)選的PAM序列TTT和含有兩個(gè)T（TTN、NTT、TNT）的靶標在ORCD中表現出較差的性能，而TCC、TCG、CCT、CTC、GTC和CTG在ORCD上表現出優(yōu)異的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現，降低CRISPR/Cas12a的cis切割活性，使CRISPR一步檢測PAM靶標的敏感度提高了1000倍，意味著(zhù)cis切割活性是CRISPR一步法檢測的關(guān)鍵。

采用非PAM序列，CRISPR一步法檢測速度快且敏感度高特異性強，30分鐘之內能實(shí)現單拷貝的DNA和RNA檢測。并且與核酸免提取技術(shù)結合，ORCD系統可在30分鐘內完成提取、擴增和檢測樣本，在臨床應用上檢測了82例百日咳博德特氏菌臨床樣本，與PCR相比，靈敏度和特異性分別為97.30%和100%。此外，RT-ORCD檢測了13例SARS-CoV-2樣本，結果與RT–PCR一致。并且僅用便攜式紫外燈或藍光燈照射即可觀(guān)察到結果。這種不受PAM限制、一步、快速、結果可視化、高敏感度和特異性的核酸檢測方法，在后疫情時(shí)代的POCT分子診斷的未來(lái)發(fā)展中顯示出巨大的潛力。它可以廣泛用于在非專(zhuān)業(yè)環(huán)境中快速檢測傳染病，例如小型診所、機場(chǎng)、田野和其他地方。

該論文的第一作者為廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生林康鳳，博士生郭劍光和碩士生郭祥舉為本文的共同第一作者，廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授、廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫院張睿博士和廈門(mén)市婦幼保健院吳謹準教授為該文章的共同通訊作者。本項目得到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2020YFA0112300）、國家自然科學(xué)基金（81972458，32071150）、福建省健康教育聯(lián)合研究項目（2019-WJ-34）的資助。

論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340938

（圖/文 李博安團隊）