李博安教授團隊開(kāi)發(fā)基于熔解曲線(xiàn)分析的在一管中免提快檢CYP2C19*2/3/17多態(tài)性的檢測方法

  單核苷酸多態(tài)性（SNP）涉及一個(gè)堿基的差異，具有重要的臨床意義。同一種疾病的患者服用相同的藥物時(shí)，可能會(huì )出現不同的反應，藥物分為顯效、有效、無(wú)效。一個(gè)SNP就可能改變蛋白的表達，從而改變藥物的靶位點(diǎn)，使其親和力降低或缺乏。因此，SNP分析有助于實(shí)現正確的診斷和有效治療。

一些傳統的檢測SNP的方法，如雙脫氧測序、焦磷酸測序、全基因組測序、qPCR等，可以揭示SNP相關(guān)重要特征，如識別SNP的類(lèi)型及其準確位置。但這些方法操作繁瑣，價(jià)格昂貴，不適合普遍使用。近期，研究團隊開(kāi)發(fā)了一種基于PCR擴增結合熔解曲線(xiàn)分析的檢測策略，可在1管內同時(shí)檢測3個(gè)SNP位點(diǎn)CYP2C19 * 2 / 3 / 17共9種基因型，并在1 h內實(shí)現快速檢測，該研究成果以題為“An Extraction-Free Method for Rapid Detection of CYP2C19 * 2/3/17 Polymorphisms in One Tube using Melting Curve Analysis”的研究論文在線(xiàn)發(fā)表于BIOTECHNOLOGY JOURNAL。

該研究通過(guò)不對稱(chēng)擴增方式對初始模板進(jìn)行擴增，使用相鄰探針和Taqman探針相結合的方式進(jìn)行檢測。CYP2C19 * 2探針的3 '端修飾FAM熒光基團，相鄰間隔1堿基的第二段探針的5 '端修飾BHQ1淬滅基團，3 ' 端修飾磷酸基團P以阻斷延伸。同樣，CYP2C19 * 17的第一段探針的3' 端修飾熒光團為ROX，第二段探針的猝滅基團為BHQ2。在研究過(guò)程中發(fā)現，一管中多個(gè)相鄰探針的存在會(huì )導致引物和探針之間的相互干擾。相鄰探針檢測的方法最終可以在一管中容納兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。因此，我們將Taqman探針與相鄰探針相結合。CYP2C19 * 3設計為Taqman探針：5 '端由HEX熒光團修飾，3 '端攜帶BHQ1淬滅基團。由于探針與模板鏈的結合力隨著(zhù)溫度的升高而降低，因此出現了熔解峰。由于純合野生型和突變型樣品之間存在一個(gè)堿基的差異，因此在熔解階段Tm值不同，最終的檢測結果表現出不同的Tm值。

此外，結合樣本釋放劑，可快速提取樣本，數秒即可完成提取，同時(shí)該檢測系統不局限于血液樣本，還可以應用于口咽和唾液樣本，增加了采樣的多樣性和便利性。我們同時(shí)檢測了93例臨床血液樣本，驗證了我們建立的檢測體系能夠快速、準確地鑒別不同基因型，并且通過(guò)Sanger測序驗證了檢測的準確性和有效性?；趯?shí)時(shí)聚合酶擴增結合熔解曲線(xiàn)分析的檢測技術(shù)因其準確、快速、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，將成為檢測和指導氯吡格雷使用的有力工具。

該論文的第一作者為廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生郭劍光，博士生尤偉鑫為本文的共同第一作者，廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授和廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫院張睿博士為該文章的共同通訊作者。本項目得到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2020YFA0112300）、國家自然科學(xué)基金（81972458，82103092）、廈門(mén)細胞治療研究項目（3502Z20214001）、福建省自然科學(xué)基金項目（2022J05312）、福建省健康教育聯(lián)合研究項目（2019-WJ-34）和" 111計劃"由國家外國專(zhuān)家局和教育部主辦（B06016）的資助。

論文鏈接：https://doi.org/10.1002/biot.202300207